“植物组织培养”的教学组织

  在《生物技术实践》模块课程标准中,植物组织培养的具体要求是“尝试植物的组织培养”。尝试是技能性目标中的模仿水平,即学生仿照教师的示范性动作完成对实验对象的操作。

  植物组织培养是一项操作复杂而精细,操作难度较大的实践活动,其操作流程包括:配制母液、培养基配制与灭菌、外植体选择和消毒、接种、形成愈伤组织、诱导丛芽和生根、组培苗移栽等操作环节。从操作的持续时间看,完成前四项活动需要一天,后三项活动需要1~2个月。为了确保在有限的时间内顺利地开展实验教学,需要确定学生动手操作的一些重要环节和步骤,并针对这些环节和步骤提前做好实验准备。

  1 实验室的准备工作

  本实验需要作好三项实验准备:一是提前配制各种母液;二是提前准备MS培养基;三是选择外植体并进行预处理。

  1.1 配制母液

  母液中含有大量元素、微量元素、激素(植物生物调节剂)和维生素等有机成分,母液浓度是实际溶液浓度的5~10倍。配制母液花费时间多,需要用到溶量瓶、移液管等精密仪器,无法由每位学生亲自操作,教师可带领部分学生在课外进行。母液的类型和配制顺序如下:

  配制母液的注意事项:⑴自来水或河水中含有大量的矿质元素,勿用配制母液;⑵配制大量元素和微量元素母液时,应将每种化合物单独溶解后,再一一混合,同时还应用适量的蒸馏水清洗烧杯内壁,并将清洗后的蒸馏水倒入混合溶液中,这样可以保证每种元素的浓度,混合时要按照教材附表中的顺序进行,最后加入的是氯化钙溶液,这样可以避免发生沉淀;⑶配制好的母液要先倒入1 000ml烧杯中,再由烧杯转入1 000ml细口瓶中,不可由容量瓶直接倒入细口瓶中;⑷注意观察母液中是否有絮状物,出现絮状物表明离子之间发生反应,需要重新配制母液;⑸植物生长调节剂难溶于水,需要碱或酸助溶,一般生长素类物质用碱(0.1mol/LNaOH1~3ml)或酒精(75~95%的酒精1~3ml)助溶,细胞分裂素类物质一般用酸(0.1mol/LHCL1~3ml)助溶,加入蒸馏水定溶时要缓慢,也可用水浴法助溶;⑹用棕色细口瓶盛装有机物母液和植物生长调节剂母液,避免透射光损害母液中的有机成分;⑺在瓶壁上贴好各种母液的标签(下图所示);⑻将配制好的母液放入冰箱中或阴凉处保存。

  MS是穆拉希吉(Murashige)和斯库克(Skoog)两位科学家第一个字母的缩写,他们于1962年为培养烟草而设计了一种培养基,这就是组培使用中最为广泛的MS培养基;标签中间一行的数字及单位表示的意义如下,例如,100ml/L,即配制1升培养基只需从母液中提取100ml即可;50mg/100ml,表明100ml母液中含有50mg萘乙酸,如取4mg的萘乙酸,只需提取8ml母液。

  除母液需提前配制好外,消毒液也需要提前配制好。外植体消毒一般采用75%的酒精、2~10%的次氯酸钠溶液等。

  1.2 培养基的配制与灭菌

  培养基的类型有很多种,通常采用MS培养基。配制培养基的流程如下:

  上述的培养基配制流程中,加入各种母液的时间是在琼脂溶化之后,这样既可避免加热使母液中的各种离子发生反应,又可避免有机物母液和植物生长调节剂因高温受到损害。将母液加入培养基的顺序是:先提取大量元素、微量元素、铁盐、有机物母液,后提取植物生长调节剂母液,切勿先提取植物生长调节剂母液,这是因为该溶液中含有酸或碱,容易与其他元素形成沉淀而失败。

  培养基通常采用高压蒸汽灭菌,灭菌时间一般为15~20min,灭好菌的培养基不易保存过长时间,通常是现用现配。在对培养基灭菌的同时,也要对解剖刀、镊子、烧杯、锥形瓶、牛皮纸等必要的仪器设备进行灭菌。

  1.3 外植体的选择和预处理

  根据植物细胞的全能性原理,选择任何活的植物体都能培养出组培苗,但不同植物的各种组织和器官的分裂能力不同,同时还要考虑消毒处理的特殊情况,因此,选择恰当的外植体进行接种既有利于消毒,避免污染,又有利于在较短时间内形成组培苗,从而提高组培成功率。下面是选择外植体时需要考虑的一些因素及说明。

  考虑的因素

    

  外植体的年龄

  一般情况外植体的年龄越小,分化的程度越小,组培的成功率就越高,因此,尽量选择幼嫩的植物组织或器官作为外植体

  外植体的大小

  外植体很小和很大都不合适,很小的外植体极容易死亡,很大的外植体不容易消毒,因此,要选择大小适中的外植体。例如,如果用菊花的芽进行组培,选取的芽可为3mm左右

  外植体所在的部位

  一般选择植物的芽尖、根尖或幼嫩的茎作为外植体,这些部位的组织分裂能力强,容易形成愈伤组织

  外植体的外观形态

  由于外植体的消毒工作非常重要,因此,要选择哪些表面相对光滑容易消毒的外植体较好

  选择好外植体后教师还要做一些预处理,以便学生进一步消毒时能有效地杀死外植体表面的微生物。预处理包括:用清水冲洗;用洗涤灵或洗衣粉清洗;芽作为外植体时要放在锥形瓶中加清水反复振荡,如果芽中有很多凹陷,还需要用毛刷轻刷;用自来水细流冲洗2~4小时左右。组培室要进行紫外线消毒,或用化学药剂如甲醛和高锰酸钾进行蒸汽消毒。操作台、接种器械、工作服等都要提前进行消毒,等等。

  2 教学建议

  2.1 重视实验原理的学习,帮助学生形成网络化的知识结构

  组培的原理及过程是教学中的重点,对于学生理解组培在生产实践中的重要性具有十分积极的现实意义,同时,有助于学生理解生命的本质,以及人类对生命现象进行干预的意义。组培的原理、过程及作用可用下面的图示表示。

  为帮助学生理解组培的原理、操作和过程,教学时可引导学生讨论下列问题:⑴灭菌和消毒的区别以及在组培中是如何应用的?⑵在脱分化和再分化过程中怎样使用植物生长调节剂? ⑶组培过程中有时需要换瓶操作,这是为什么(改变培养基中的植物生长调节剂的浓度比例)? ⑷组培过程中的每一步都需要光照吗(愈伤组织的形成不一定需要光照,但丛芽和根的形成需要光照)?⑸组培中用的蔗糖作为能源和原料物质,用葡萄糖行不行(使用蔗糖主要是考虑经济因素,也可用葡萄糖或果糖替代)?⑹花药离体培养获得的植物幼苗都是单倍体吗(不是,也有正常的植物体)?等等。

  2.2 合理安排时间,确保学生动手操作关键的步骤

  既然我们不可能让每一位学生都经历组培的全过程,但又要让学生实践操作,因此,选择什么样的操作环节让学生实践就显得尤为重要。以下的几种方案供参考和借鉴。

  方案1:学生完成外植物体的消毒和接种工作。外植体的消毒工作至关重要,需要那些操作认真、细致的学生才能够很好地完成,因此这种方案要求学生具备一定的操作技能,并且做到耐心、细致。外植体的消毒流程如下。

  上述流程中,酒精起到表面消毒的作用,次氯酸钠溶液的消毒作用更强。这两种消毒剂的使用时间可根据外植体的种类决定,一般而言,芽尖等相对幼嫩的组织消毒的时间要短些,而茎、根的消毒时间可用时长一些。总的原则是,既要杀灭外植体表面的全部微生物,又要避免损害和杀死外植体本身。除上述的消毒剂外,过氧化氢溶液(10%,5~15min)和氯化汞溶液(0.1~0.5%,2~7min)也是极好的消毒剂。通过以上操作学生能体会到无菌对于组织培养成功的重要作用,从而提高他们的实验操作技能、严谨认真的科学精神和态度。

  方案2:学生完成愈伤组织的继代培养或分化换瓶。由于减少了外植体消毒这一重要的环节,操作相对简单,成功率很高,学生容易获得成功的满足感。因此,这种方案是针对那些实践操作能力一般的学生而设置的。一方面可以让学生体验组培接种的操作过程,另一方面保证了实验的成功率,节约了实验时间。

  方案3:探讨植物生长调节剂的不同浓度对组培的影响。为强凋不同浓度的植物生长调节剂在诱导愈伤组织分化形成丛芽或生根中的作用,可配制植物生长调节剂不同浓度的培养基,然后让学生根据自己的意愿选择这些培养基进行换瓶操作。当学生看到植物生长调节剂的神奇作用时,一定能够深刻地理解激素对植物生长的重要作用,从而激发学生浓厚的探究兴趣。下表为组培中常用的植物生长调节剂的类型及作用。

  调节剂

  名称

  浓度范围

  作用

  生长素类

  24-二氯苯氧乙酸(24D)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)等

  0.015mg/L

  促进细胞的伸长和分裂,促进愈伤组织和根的形成

  细胞分裂素类

  激动素(KT)、6-苄基腺嘌呤(BA6BA)、玉米素(ZT)等

  0.510mg/L

  促进细胞的横向生长和分裂,促进芽的分化和形成

  诱导外植体形成不定芽时,一般用细胞分裂素类物质的浓度较高,生长素类物质的浓度较低;如果这两类物质的浓度相同,则有利于形成愈伤组织;如果其比值小于1,则有利于生根。教学中可选择不同的配比浓度,探讨哪种配比浓度更有利于芽的形成,哪种配比浓度更有利于根的形成。

  2.3 成立课外活动小组,培养学生中的积极分子

  组培实验的操作繁多而复杂,需要教师提前做好大量的准备工作,因此,成立活动小组,培养学生中的积极分子十分重要。活动小组主要完成以下工作:(1)帮助老师完成实验室的前期准备,如各种母液的配制、各种培养基的配制和灭菌,等等;(2)做好接种的示范操作,并拍成录像,提供给其他学生借鉴;(3)接种后的观察和记录;(4)进行继代培养和分化转瓶;(5)幼苗的移栽及管理;(6)进行课题延伸项目的研究,等等。

  参考文献:

  1. 朱正威、孙万儒、赵占良主编. 选修1生物技术实践. 北京:人民教育出版社,2007,7:32-40

  2. 陈颖编著.“克隆”与组织培养. 北京:中国物资出版社,2004,5

  3. 顾淑荣等编著. 园艺植物组织培养和应用. 北京:北京科学技术出版社,1989,8

  本文发自《生物学通报》08年第12期


微信“扫一扫”, 关注我们相关的信息