MiR-146a 调节 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞迁移及其分子机制

  摘要:目的 研究 miR-146a 及其靶基因 EGFR 对乳腺癌细胞迁移的影响。方法 用终浓度为 50、100、200 和500 μg/L的重组可溶性 TRAIL(rsTRAIL)持续刺激对 TRAIL 敏感的 MDA-MB-231 细胞 4 周,筛选得到 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞 MDA-MB-231/TR。RT-PCR 检测 miR-146a 的表达;Transwell 实验以及划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力;双荧光素酶报告基因分析以及 Western blot 鉴定 MDA-MB-231/TR 细胞中 miR-146a 与 EGFR 基因的靶向调控关系;Western blot 检测 DR4、DR5、IRAK1、CXCR4、p-IκBα、IκBα、caspase 8 和 caspase 3 的蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀技术(ChIP)分析 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231/TR 细胞中 NF-κB P65 亚基与 miR-146a 启动子区的结合情况。结果 TRAIL 细胞毒作用不敏感的人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231/TR 中 miR-146a 的表达降低,并引起其靶基因 EGFR 的表达增加,最终导致 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞迁移能力增强。同时发现 NF-κB 参与 miR-146a低表达的调控。结论 miR-146a 对 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞迁移起重要的调节作用。

  关键词: TRAIL;乳腺癌细胞;miR-146a;迁移

  中图分类号:R 73-3 文献标志码:A

  The molecular mechanism of regulation of TRAIL-insensitive breast cancer cell migration by miR-146a

  LIU Dan,JIANG Ming-hong,LIU Min,GAO Jing,LIU Yan-xin,ZHENG De-xian *

  (National Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences,CAMS & PUMC,Beijing 100005,China)

  Abstract: Objective To investigate the effection of miR-146a and its target gene EGFR on the migration of breast cancer cells. Methods Recombinant soluble TRAIL (rsTRAIL) was used at a final concentration of 50,100,200,and 500 μg/L to continually stimulate TRAIL-sensitive MDA-MB-231 cells for four weeks,and a TRAIL-in-sensitive breast cancer cell line named MDA-MB-231/TR was screened. MiR-146a expression level was evaluated using RT-PCR. Transwell cell invasion assay and wound-healing experiment were performed to examine the migration of breast cancer cells. The relationship between miR-146a level and EGFR expression was identified in MDA-MB-231/TR cells by dual luciferase reporter assay and Western blot. The expression of DR4,DR5,IRAK1,CXCR4,p-IκBα,IκBα and apoptosis-related proteins were detected by Western blot. Chromatin immunoprecipitation(ChIP) analysis revealed the binding activity of NF-κB P65 subunit to the binding sites of miR-146a promoter element in MDA-MB-231/TR cells. Results MiR-146a expression in a TRAIL-insensitive breast cancer cell line MDA-MB-231/TR was decreased significantly. Down-regulation of miR-146a increased its target EGFR expression,and eventually promoted breast cancer cell migration. Furthermore,we found that NF-κB regulated the low expres sion of miR-146a in the MDA-MB-231/TR cells. Conclusions miR-146a plays an important regulatory role in the migration of TRAIL-insensitive breast cancer cells.

  Key words: TRAIL; breast cancer cells; miR-146a; migration

  肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡,而对多数正常细胞没有毒副作用,有望成为一种新型的抗肿瘤药物[1]。但随着 TRAIL 抗肿瘤功效研究的深入,有研究报道,亚毒性剂量 TRAIL 反复刺激可导致 TRAIL 敏感的 MDA-MB-231 乳腺癌细胞变为 TRAIL 不敏感的细胞,从而影响其疗效[2]。因此,阐明 TRAIL 不敏感的肿瘤细胞内各种分子事件的变化规律,将为提高 TRAIL 的疗效提供理论依据。

  MicroRNA 是一类在转录后水平调控基因表达的非编码小 RNA 分子。它们与肿瘤的发生发展密切相关[3-4]。目前关于 miRNAs 参与调控 TRAIL不敏感肿瘤细胞生物学功能的研究尚少。本研究选用对 TRAIL 细胞毒作用不敏感的 MDA-MB-231乳腺癌细胞为模型,发现 miR-146a 对 TRAIL 不敏感的 MDA-MB-231 细胞迁移具有重要调控作用,并探讨了其分子机制。

  1 材料与方法

  1. 1 试剂

  miRNA 模拟体和 NC 随机对照寡核苷酸(上海吉玛制药公司)。检测 miR-146a 和内参 U6 snRNA表达的探针、TaqMan microRNA 反转录试剂盒以及TaqMan MicroRNA Assays(ABI 公司)。萤火虫萤光素酶报告基因载体 pMIR-REPORT TM (Life technologies 公司),内参载体 pRL-TK 以及 Dual-Luciferase 检测试剂盒(Promega 公司)。用 Lipofectaminem2000 转染试剂盒(Invitrogen 公司)。Transwell 培养板(Corning 公司)。重组可溶性 TRAIL(rsTRAIL)由本实验室制备[5] 。Human EGF ( PeproTech 公司)。DR4、DR5 和 CXCR4 抗体 ( Abcam 公司),IκB、p-IκBα、pro-caspase3/8 和 cleaved caspase3/8 抗体(Cell Signaling Technology 公司),IRAK 抗体(Proteintech Group 公司),GAPDH 抗体(上海康城生物工程有限公司),所有的二抗(中杉金桥生物技术有限公司)。

  1. 2 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞模型的建立

  人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 由本实验室保存。用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基、在37 ℃和 5% CO 2 细胞培养箱中培养。用终浓度为50、100、200 和 500 μg/L 的 重 组 可 溶 性 TRAIL(rsTRAIL)持续刺激对 TRAIL 敏感的 MDA-MB-231细胞4 周,筛选培养仍然存活的 MDA-MB-231 细胞,命名为 MDA-MB-231/TR,即为 TRAIL 不敏感的乳腺癌细胞。将其在含有500 μg/L rsTRAIL 的 RPMI 1640 培养基中培养和传代。

  1. 3 MTT 检测细胞存活

  细胞按每孔10 4 个/100 μL的密度接种于 96孔细胞培养板培养过夜。将 rsTRAIL 用无血清RPMI 1640 培养基稀释至不同浓度并加入细胞培养孔中,在培养箱中继续培养24 h后,用 MTT 比色法进行细胞活性检测。在酶标仪波长570 nm处测定光吸收值(A),参照波长630 nm。测得结果按下述公式计算细胞凋亡率:细胞凋亡率(% ) = (1 -实验组光吸收值/对照组光吸收值) × 100%,每组至少设置3个复孔。

  1. 4 实时定量 PCR 检测 miR-146a 表达

  miR-146a 表达的检测操作过程严格按照美国ABI 公司提供的说明书进行。实时定量 PCR 反应条件为:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共计 40 个循环。

  1. 5 细胞迁移能力测定

  1. 5. 1 Transwell 小室实验 用不含血清的 RPMI 1640 培养基制备单细胞悬液,调整细胞数为2. 5 ×10 5 个/mL。上层小室加入400 μL细胞悬液,下层小室加入600 μL含 20% 胎牛血清的 RPMI1640培养基或终浓度为100 μg/L的表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),再将 Transwell 板置于37 ℃、5% CO 2 细胞培养箱内培养24 h。用棉签擦去上层细胞,无水乙醇固定细胞20 min,风干无水乙醇。固定后的细胞用 Gimsa 染色15min,PBS 洗去残余染料。在显微镜下观察并拍照,每组随机选取10 个视野进行计数,计算平均值。

  1. 5. 2 划痕实验 将生长状态良好的细胞接种于 6孔板。待细胞贴壁面积达 90% 左右并呈单层贴壁状态生长时,用无菌的10 μL吸样头在 6 孔板内垂直划痕,并做好标记。PBS 洗两次,弃去漂浮细胞。加适量培养基,置于37 ℃、5% CO 2 细胞培养箱中继续培养24 h后,在显微镜下观察并拍照。

  1. 6 双荧光素酶报告基因分析

  实验步骤按照 Promega 公司提供的双荧光素酶报告基因分析系统操作说明书进行。

  1. 7 Western blot 检测蛋白表达

  收集细胞,加入细胞裂解液,冰上裂解30 min。4 ℃ 12 000 r/min离心20 min,吸取上清液,加热变性。蛋白经 SDS-PAGE 分离后,半干法转至 PVDF膜上。用 5%脱脂奶室温封闭1 h后,将膜置于用抗体稀释液(碧云天公司)适当稀释的一抗溶液中,4 ℃轻摇孵育过夜(或室温孵育2 h)。洗膜缓冲液(tris buffered saline with tween-20,TBST)洗膜 3 次,每次10 min,再将膜置于封闭液稀释的二抗溶液中,室温轻摇孵育2 h。洗膜缓冲液洗膜 3 次,吸干膜上多余水分。最后,将 ECL 反应液均匀覆于膜上反应1 min,在暗室中用 X 光片压片显影。

  1. 8 染色质免疫共沉淀(ChIP)

  用 EZ CHIP KIT 22 ASSAYS(Millipore)进行染色质免疫共沉淀实验,实验操作依照试剂盒说明书。免疫沉淀后洗脱下来的 DNA 进行 RT-PCR 检测。

  1. 9 统计学分析

  所有实验数据以均数 ± 标准差(x ± s)表示,使用 SPSS 17. 0 统计软件,数据通过 t 检验分析。

  2 结果

  2. 1 MDA-MB-231/TR 乳腺癌细胞低表达 miR-146a

  50 μg/L rsTRAIL 处理24 h,MDA-MB-231 的凋亡率为 40%(P <0. 05),但在同样的浓度和条件下,MDA-MB-231/TR 几乎全部存活,用4 mg/L高浓度的 rsTRAIL 处理,其存活率仍大于 90% (图 1)。相对于 MDA-MB-231 细胞,MDA-MB-231/TR 细胞内miR-146a 的表达(0. 46 ±0. 04)出现显著下降(P <0. 01)。

  2. 2 MDA-MB-231/TR 细胞迁移能力强并高表达EGFR

  MDA-MB-231 /TR 细胞具有高迁移能力(图2)。进一步的研究发现,MDA-MB-231 /TR 细胞还高表达 EGFR 分子,并且100 μg/L EGF 诱导的MDA-MB-231 /TR 细胞的迁移能力更强(P <0. 01)(图 3)。

  2. 3 MDA-MB-231/TR 细胞 miR-146a 的低表达促进 EGFR 表达,进而导致迁移力增强

  双荧光素酶报告基因分析结果证明,miR-146a与 EGFR 3'UTR 区结合(图 4A)。与对照组(mimics NC 转染组)比较,miR-146a 的过表达显著抑制了EGFR 的表达(P <0. 01)(图 4B),并且过表达 miR-146a 使 MDA-MB-231/TR 细胞的迁移能力下降至1/5 (P <0. 01)(图 5)。

  A. the effects of rsTRAIL on the viability of MDA-MB-231 cells,* P < 0. 05 compared with the TRAIL-nontreated cells;

  B. the effects of rsTRAIL on the viability of MDA-MB-231/TR cells

  图 1 TRAIL 敏感的 MDA-MB-231 和不敏感的 MDA-MB-231/TR 细胞对 rsTRAIL 的敏感性

  Fig 1 The effects of rsTRAIL on the viability of MDA-MB-231 and MDA-MB-231/TR cell lines by MTT assay

  2. 4 MDA-MB-231/TR 细胞中 IRAK1 和 p-IκBα的表达显著升高

  在这两株细胞中,DR5 和 CXCR4 的表达量几乎没有差别,但在 MDA-MB-231/TR 细胞中 DR4 蛋白的表达明显降低,IRAK1 和 p-IκBα 的表达则显著升高(P <0. 01)(图 6)。在这两株细胞中过表达或敲低miR-146a 的表达,TRAIL 诱导的细胞凋亡信号通路中的 caspase 8 和 caspase 3 的活性均没有差异(图7)。

  2. 5 MDA-MB-231/TR 细胞中 NF-κB 调节 miR-146a 的表达

  与 MDA-MB-231 细胞相比,MDA-MB-231/TR中 NF-κB P65 亚基与 miR-146a 启动子区两个结合位点的结合能力都显著下降 (0. 11 ± 0. 02,P <0. 01)(图 8)。

  3 讨论

  一些对 TRAIL 敏感的肿瘤细胞在亚毒性剂量的 TRAIL 反复刺激下可能产生对 TRAIL 的抗性[6] 。阐明肿瘤细胞产生抗性的分子机制对 TRAIL 的临床应用具有十分重要的意义。近几年来,有科学家开始研究 TRAIL 抗性细胞中 miRNAs 的表达谱。例如有研究显示,在 TRAIL 抗性的非小细胞肺癌细胞中,miR-221 和 miR-222 能影响 TRAIL 诱导的细胞凋亡[7] 。本研究发现 MDA-MB-231/TR 细胞低表达miR-146a,并且其迁移能力显著增强。这与 miR-146a 参与调控乳腺癌细胞迁移的报道相一致 [8-9] 。有趣的是,当在 MDA-MB-231/TR 细胞中过表达miR-146a 或者在 MDA-MB-231 细胞中抑制 miR-146a 的表达,TRAIL 诱导细胞凋亡的能力都没有发生变化,提示 miR-146a 并不参与调控 TRAIL 诱导细胞凋亡的信号通路。

  EGFR 是在肿瘤细胞转移、黏附等过程中起重要作用的表皮生长因子受体家族的成员。有研究称 miR-146a 可以通过靶向调控 EGFR 的表达来影响肿瘤细胞的迁移 [9-10] 。本研究发现在MDA-MB-231 /TR 细胞中 EGFR 的表达量升高,并 且在该细胞中miR-146a能够靶向调控EGFR的表达。进一步在细胞中过表达 miR-146a,EGF诱导的细胞迁移能力显著降低。这些结果表明在 MDA-MB-231 /TR 细胞中,miR-146a 的低表达

  使 EGFR 蛋白表达量增加,最终导致 EGF 诱导的细胞迁移能力增强。

  众所周知,EGFR 能够调控 NF-κB 的信号通路,并且在某些 TRAIL 抗性的细胞中 NF-κB 也被显著激活[11-13] 。本研究揭示在 MDA-MB-231/TR 细胞中,NF-κB 的活化水平确实显著增加。因此,miR-146a 可以通过调控 EGFR 的表达来间接影响 NF-κB的活化,进而导致细胞的迁移能力发生变化。

  本研 究 还 表 明 在 MDA-MB-231/TR 细 胞 中IRAK-1的表达也显著增加。IRAK-1 是 NF-κB 上游的活化因子,也是 miR-146a 公认的靶基因之一[14] 。因此,miR-146a 也可以通过靶向调控 IRAK-1 的表达来改变 NF-κB 的活化水平,最终影响细胞的迁移。在 MDA-MB-231/TR 细胞中,虽然 NF-κB 被显著活化,miR-146a 又是受 NF-κB 调控的 miRNA 分子,但本研究发现 NF-κB 与 miR-146a 启动子区两个结合位点的结合都明显降低,这在一定程度上解释了对 TRAIL 抗性的细胞中低表达 miR-146a 的原因。同时提示,虽然抗性细胞中 NF-κB 的活化增加,但是他并不影响 miR-146a 的表达,而是可能通过参与其他途径来促进细胞的迁移。本研究结果为TRAIL 应用于临床治疗乳腺癌患者以及改善乳腺癌的预后提供了理论基础,miR-146a 也有望成为乳腺癌诊断和治疗的新靶点。

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