研究神经发生的方法

传统的观点一直认为,神经发生(neurogenesis)只存在于动物胚胎期或出生后的发育早期,然而,近二三十年来的研究结果逐步而又彻底地改变了我们对于脑发育的观念。Kaplan[1]1977年发现3月龄大鼠(rat, Rattus norvegicus domestica)的齿状回(dentate gyrus)和嗅球(olfactory bulb)的颗粒层存在新生神经元。20世纪80年代,Nottebohm[2]又在成年金丝雀(canary, Serinus canaria)的发声控制最高中枢HVChigh vocal center)中发现了新生神经元。成年动物的新生神经元可能具有多方面的功能,比如鸟类并不仅局限于鸣啭行为(与发声、学习记忆有关),可能具有更广泛的意义。也许作为一般的行为学策略,成鸟脑中神经发生反映了鸟类中枢神经系统需以较快的神经更迭速率来适应长期飞行生活。

“神经发生”这一过程至少包括以下几个重要内容:细胞增殖(proliferation)、迁移(migration)、分化(differentiation)和存活(survival)。动物脑中的神经发生是一种年龄依赖性事件,随着年龄增加,绝大多数脑区的神经发生下降。成年脑中的神经发生既受一些生理性因素的调节,如多种生长因子[3]、性激素、糖皮质激素、兴奋性的神经递质等,又受一些药理学因素的调节,还受到环境及社会多种因素的调节,这种调节是复杂多变的,现在研究最多的上调因素是丰富多彩的环境(enriched environment)和复杂的经历(experience[4][5];而下调因素则主要是应激反应(stress)。虽然现在研究神经发生的方法已经比较成熟,但在定量研究方面还存在着一些方法上的问题。

    1  3H-TdR放射自显影技术

    1.1  原理

20世纪60年代,3H-TdR3H-thymidine3H-胸腺嘧啶)放射自显影技术被引入到现代神经科学研究中。运用这种方法,Altman[6]报道了在成年大鼠和猫(cat, Felis catus)脑的不同结构,如嗅球、海马、大脑皮层中存在新生神经元。15年后,Kaplan[1]3H-TdR放射自显影在超微结构上证明了成年大鼠嗅球、海马和新皮层中有新生神经元。3H-TdR在细胞周期的S期可掺入到核DNA中,经核乳胶曝光、显影后,3H-TdR在特定细胞的掺入量可由覆盖在细胞上的银粒数直接反映。当3H-TdR注射入恒河猴(rhesus monkeyMacaca mulatta)心室后,它在血流中存在的时间不超过10 min [7]。因此,3H-TdR为测量细胞的最后分裂时间提供了一个高精确度的工具。

    1.2  实验流程

(1)    对实验动物的胸大肌注射适当剂量的3H-TdR

(2)    按照有关规定对实验动物进行饲养,存活一定的时间;

(3)    处死动物,取脑组织,切成小于5 mm厚度的切片;

(4)    对脑组织切片进行脱水、脱脂处理;

(5)    脱脂后的脑片,在无尘的环境下充分晾干,在暗室中涂核乳胶;

(6)    封于干燥的暗盒中,在4 曝光4周左右;

(7)    对脑组织切片进行显色处理:显影、停影、定影;

(8)    封片,在显微镜下观察。

    2  BrdU免疫组织化学技术

    2.1  特点

20世纪90年代,几种技术的发展使成年啮齿类的神经发生研究普遍建立起来[8][9][10]。首先是细胞类型特异性标记物,如NeuN抗体(神经元的特异性抗体)、GFAP抗体(神经胶质细胞的特异性抗体)等抗体的引入,通过这些特异性的抗体,结合免疫组织化学技术可以鉴定新生细胞的类型。这些抗体也可与3H-TdR结合使用来确定新生细胞的特性。

其次是BrdU5-bromo-2-deoxyuridine5--2-脱氧尿苷)作为另一种体内细胞增殖的标记物的应用。BrdU类似于3H-TdR,可在S期掺入到细胞DNA中,因此同3H-TdR一样可用来检测经历增殖的细胞。BrdU抗体的对应抗原是含有BrdU的单链DNA,所以反应时必须使DNA单链完全暴露(可用NaOHHCl或热处理达到变性的目的)。BrdU的优点在于它无放射性,对机体和单个细胞的毒性小;操作时不需要特殊的实验设备(如3H-TdR放射自显影需要暗室);实验程序所经历的周期短,用免疫组织化学的方法在两三天内即可出结果,而3H-TdR放射自显影可能需要4-12周的时间;3H-TdR的放射性只能穿过1 mm厚的组织切片,因此只有位于切片表面2-3 mm3H-TdR可以检测出来,BrdU30 mm厚的切片上可清楚地辨别出。

第三,共聚焦显微镜(confocal microscopy)的运用可明确地显示出BrdU与细胞特异性抗体双标的细胞。运用这些技术,已经发现成年恒河猴和人类(human, Homo sapiens sapiens)的齿状回中存在有神经发生。

尽管BrdU有如此多的便利,但在使用它时也存在一些问题,应考虑周全。BrdU是有毒性的,所以一般情况下使用的BrdU是低剂量的;BrdU标记细胞数量会随着剂量的升高而升高,所以在使用时必须确定一个合适的剂量,因为低剂量的BrdU会使有些经历增殖的细胞检测不出来。尽管如此,BrdU还是目前最理想的检测细胞增殖的标记物之一。

    2.2  实验流程

(1)    对实验动物的胸大肌注射适当剂量的BrdU,并根据实验需要让动物存活一定的时间;

(2)    处死动物,取脑组织,根据需要切成一定厚度的切片;

(3)    对切片进行酸、碱或热处理,以达到DNA变性的目的;

(4)    进行免疫组织化学反应(一抗孵育、二抗孵育、显色等);

(5)    可以在BrdU免疫组织化学反应的前、后进行其他的抗原抗体反应,进行双标或多标实验;

(6)    封片、观察。

    主要参考文献

[1] Kaplan, M.S. and Hinds, J.W. (1977)  Neurogenesis in the adult rat: EM analysis of light radioautographs.   Science 197: 1092-1094

[2]  Paton, J.A. and Nottebohm, F. (1984)  Neurons generated in the adult brain are recruited into functional circuits.   Science 225: 1046-1048

[3]  Yoshimura, S., Teramoto, T., Whalen, M.J., et al. (2003)  FGF-2 regulates neurogenesis and degeneration in the dentate gyrus after traumatic brain injury in mice.   J. Clin. Invest. 112(8): 1202-1210.

[4]  Briones, T.L. (2006)  Environment, physical activity, and neurogenesis: implications for prevention and treatment of Alzhemier's disease.   Curr. Alzheimer Res. 3(1): 49-54

[5]  Young, D., Lawlor, P.A., Leone, P., et al. (1999)  Environmental enrichment inhibits spontaneous apoptosis, prevents seizures and is neuroprotective.   Nat Med 5(4): 448-453

[6]  Altman, J. (1969)  Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. Cell proliferation and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting neurogenesis in the olfactory bulb.   J Comp Neurol 137: 433-458

[7]  Nowakowski, R.S. and Rakic, P. (1974)  Decrease of exogenous thymidine-3H in the plasma of pregnant rhesus monkeys.   Cell Tissue Kinet 7: 189-194

[8]  Lichtenwalner, R.J, Forbes, M.E., Sonntag, W.E., et al. (2006)  Adult-onset deficiency in growth hormone and insulin-like growth factor-I decreases survival of dentate granule neurons: insights into the regulation of adult hippocampal neurogenesis.   J. Neurosci. Res. 83(2): 199-210

[9]  Eriksson, P.S., Perfilieva, E., Bjork-Eriksson, T., et al. (1998)  Neurogenesis in the adult human hippocampus.   Nat Med 4(11): 1313-1317

[10]  Kornack, D.R. and Rakic, P. (1999)  Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.   Proc Natl Acad Sci USA 96: 5768-5773

    自《生物学通报》2006年第5期


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