选修1《生物技术实践》常见问题析疑

  《生物技术实践》是我国普通高中首次开设的一门实验课,但并非实验指导手册那样简单。对于实验,在教学过程中总会遇到许多问题。这些问题的解决,对于更好地落实本模块的教学目标具有重要作用。以下撷取一些有代表性的问题,与老师们探讨。

一、教师如何指导学生选择课题?

按照《普通高中生物课程标准》(实验)规定,学生选学本模块16个课题中的5~7个后,考核通过,即可获得本模块应得的2个学分。那么,这5~7个课题如何来选?

教师在指导学生选择课题(或教师选择课题)时,应既尊重学生的选择,又结合当地教学资源的实际情况,同时兼顾传统生物技术和现代分子生物技术。应该明确,无论课题针对的是哪项具体技术,它都同样能够培养学生的科学探究能力,课题的教育价值并不因为技术是现代技术或传统技术而提升或降低。但教师在指导学生选择时,不宜全选传统技术或现代分子生物技术,也不宜全选相对简单的或相对难的。现给出一个建议性的选择方案:

传统发酵技术的应用(1个);

微生物的培养与应用(2个:1个基础培养,1个选择性培养);

植物的组织培养技术(1个:花药培养技术操作较难,可不选择);

酶的研究与应用(1个);

DNA和蛋白质技术(1个);

植物有效成分的提取(1个)。

若有条件应鼓励学生多选多做。

二、实验条件达不到要求,如何完成实验?

本模块为实验课,重在实践,重在做,衡量教师教学效果的标准不是看教师讲课讲得如何精彩,而是在引导学生完成实验。教师在进行本模块教学时,首先必须克服畏难情绪,不要一上来就觉得这个模块没办法实施。

实验课总是需要很多的仪器设备。目前各学校仪器的装备情况确实制约了本模块的实施,致使许多老师把做实验变成了讲实验。即使没有条件完成实验的操作部分,也必须让学生进行自主研习和设计出可行的实验操作方案,并对实验结果进行预期和分析讨论。希望教师能着眼于学生全面发展和终身发展的需要,勇于实践,尽量创造条件努力完成实验,不要打退堂鼓。

一些教师在看到人教版本模块教师教学用书后所附的实验光盘(将在2007年秋季与大家见面)后,第一反应就是这些实验我们没办法开展。理由是,这里所涉及的仪器我们连见都没见过。有些仪器有些教师确实没有见过,但我们不能说因为没有可调式移液器就不能进行实验了:可用移液管来代替可调式移液器。同样,没有超净工作台,我们可以在酒精灯旁边进行操作。需要说明的是,人教版选修1教师教学用书后所附的光盘可以说给教师展示了生物仪器的发展情况,这些仪器很可能马上就要走进我们的中学实验室。

目前《中小学理科实验室装备规范》已经发布。这个规范是教育部教学仪器研究所针对新课程的实施对中小学理科实验室提出的新要求而起草的。该规范除要求中学配备实验室、实验员室、准备室、仪器室、药品室、生物园地等外,还建议设置科学探究室(为学生进行科学探究创设条件,方便学生查阅相关资料,方便学生制定实验计划和设计实验方案,进行探究性学习和学科实验活动)、培养室(进行组织培养)等。相信这个规范会对新课程中实验的实施起到推动作用。

三、教学过程中遇到的具体问题

1.专题1中课题1:果醋是在果酒产生基础上发酵产生的,在制果酒时需无氧发酵,在无氧条件下,好氧型的醋酸菌不是要大量死亡吗?后期果醋发酵哪来的醋酸菌呢?

在我们的实验中,前期果酒厌氧发酵产生酒精,并不是严格厌氧,因此有少量的醋酸菌存留,当转入好氧发酵时,残存的醋酸菌会大量繁殖,产生醋酸。同时,在我们的实验条件下并不是严格无菌,通入的空气中会有一些醋酸菌,带到发酵液中,大量繁殖,而其他的菌种因不适应这种条件而不能繁殖。在工业上,后期醋的发酵是需要人工接种醋酸菌的,以保障生产的正常进行,而不是采取我们实验的方法。

在实际操作时,由于菌株的量较少,可能需要很长的时间。为了缩短时间,我们可以从市场上买一些菌株进行接种或先将一瓶醋打开盖暴露于空气中,一段时间后在醋的表面有一层薄膜(实际是醋酸菌),可以用这层薄膜进行接种,这样可以明显缩短制作果酒、果醋的时间。

2.专题1课题2:在制作腐乳时,将豆腐块摆放在稻草、粽叶上的目的是什么?

这些材料上含有的毛霉孢子较多,可以达到接种的目的。当然,也可将豆腐块暴露在空气中一段时间进行自然接种。

3.专题2课题1:在进行平板划线时为什么不能划破培养基?

原因有两个:其一,一旦划破,会造成划线不均匀,难以达到分离单菌落的目的;其二,存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落,菌落会沿着划破处生长,会形成一个条状的菌落。

4.平板划线的操作方法仅限于教材介绍的一种方法吗?

平板划线在实际操作中有多种方法,教材详细介绍了交叉划线的方法,第14页给的图示就是另外一种方法(连续划线法)。当然,还有很多其他的方法(如下图)。学生在操作时,还会创造出许多别的方法,如有些同学划出一个“刘”字。

5.专题2课题2:滤膜的作用是什么?能用擦镜纸来代替吗?

本课题中所提到的滤膜是用来过滤细菌的,不能用擦镜纸来代替。因为滤膜(如醋酸纤维素滤膜)的孔径很小,细菌不能通过,被截留在膜的表面。同样的道理,在进行细胞培养时,有时需在培养基中添加血清、生长因子、抗生素等,这些物质不能用高压灭菌的方法,因此常常将这些物质配成溶液,用滤膜进行过滤,在使用时加入到已经灭菌的培养基中。直径为0.22 mm的滤膜,可以达到完全除菌的目的。擦镜纸的孔径是非常大的,达不到除菌的目的。

6.专题4课题3:酵母细胞的固定化,实验看似简单,但不容易做好,在实验操作过程中应该注意什么问题?

本实验中有两步操作比较重要:配制海藻酸钠溶液和海藻酸钠溶液与酵母细胞混合。在配制海藻酸钠溶液时,若用酒精灯加热,注意小火或间断加热,否则容易焦糊。有条件的可以用微波炉高火加热1~1.5 min即可。用90 ℃左右的水浴加热更好,水分损失少,也不会焦糊。海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时,第一要注意火候:温度太低,海藻酸钠溶液容易凝固,温度太高,会杀死酵母细胞;第二要混合均匀,又要防止出现气泡。

学生的实验结果,可能有以下情况:(1)固定好的酵母细胞为圆形凝胶珠,位于氯化钙溶液的底部;(2)托尾的凝胶珠(蝌蚪状),原因可能为溶液太稀(酵母细胞浓度太低)或注射时针头离氯化钙溶液的距离太短;(3)漂浮的凝胶珠,这说明海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时出现气泡。

7.专题5课题2:PCR循环参数是如何确定的?

(1)变性时间是如何确定的?

在选择的变性温度下,DNA分子越长,两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或时间太短,模板DNA中往往只有富含AT的区域被变性。在PCR的第一个循环中,有时常把变性时间设计为5 min,来增加大分子模板DNA彻底变性的概率,又称此为预变性。当模板DNA的G+C含量超过55%时,需要更高的变性温度,来源于古细菌的DNA聚合酶比TaqDNA聚合酶更能耐受高温,因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。

(2)复性温度的确定有什么考虑?

复性过程(即退火)采用的温度至关重要。如果复性温度太高,寡核苷酸引物不能与模板很好地复性,扩增效率将会非常低。如果复性温度太低,引物将产生非特异性复性,从而导致非特异性的DNA片段的扩增。

(3)延伸的时间是如何确定的?

Taq DNA聚合酶在最适反应温度(72~78 ℃)下聚合速率约为2 000 bp/min。根据多数研究者的经验,确定了一个规则,即:靶基因的每1 000 bp的扩增产物的延伸时间被设计为1 min,以此类推。对于PCR的最后一个循环,许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上,以使所有扩增产物完成延伸,这又称为后延伸。

(4)循环数目一般都为30,这个数值是怎么来的?

PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率。一旦PCR反应进入几何级数增长期,反应会一直持续下去,直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说,扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物,而非特异性的扩增产物低到难以检测的程度。用TaqDNA聚合酶在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。

8.专题5课题2:DNA含量的计算公式中数字50是怎么来的?

DNA含量的计算公式为:DNA含量(mg/mL)=50(260 nm的读数)稀释倍数。公式中50的含义是:在标准厚度为1 cm的比色杯中,OD260为1相当于50 mg/mL的双链DNA,40 mg/mL的RNA,37 mg/mL的单链DNA以及30 mg/mL的寡核苷酸,因此若是测定RNA的含量,50应该换为40。从这里也能够看出,这个公式适用的前提是PCR是成功的。PCR是否成功,可用电泳来初步鉴定。

9.专题5课题3:什么是变性胶?SDS的作用是什么?

聚丙烯酰胺凝胶根据其中是否加入变性剂而分为变性胶和非变性胶。所谓变性胶是指在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDSsodium dodecyl sulfate,十二烷基磺酸钠、DTT(dithiothreitol,二硫苏糖醇)或尿素而制成的凝胶。SDS是一种阴离子表面活性剂,它能破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的构象,特别是在有强还原剂DTT等存在的情况下,蛋白质分子内的二硫键被还原,这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合从而形成带负电的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子与SDS充分结合后,所带的SDS的负电荷远远大于蛋白质本身的电荷量,因而就掩蔽或消除了不同种类蛋白质分子间的电荷差异对电泳迁移率的影响。此外,蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状类似椭圆长棒状,不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度是相近的,只是长轴长度随蛋白质分子量的大小而正比变化。这样,蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率就不再受蛋白质形状和所带电荷的影响,也就是说,此时电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量。因此,SDS-PAGE变性胶是一种非常好的检测蛋白质分子量、分离蛋白质和亚基组分分析的方法。它还能使DNA和RNA变性,并使其带上同种电荷,从而准确地分离DNA和RNA。通常用于分离蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶属于变性胶。

反之,在聚丙烯酰胺凝胶中不加入SDS、DTT或尿素而法制成的凝胶属于非变性胶。非变性胶中蛋白质迁移的速率不仅取决于蛋白质的大小,还包括其电荷或者形状。此种电泳方法由于pH值影响蛋白质所带的净电荷,对pH值的变化敏感。可分离开折叠蛋白和非折叠蛋白,单体和二聚体,蛋白复合物。


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