《普通高中课程标准实验教科书生物(选修1)》部分内容答疑

 

    高中生物课标教材已经陆续在全国实验区开始实验了,在这个过程中,老师们对实验总是会有更多的问题,下面就近期老师们的一些问题作一解答。

1.教材第2页中提到“在有氧条件下,酵母菌进行有氧呼吸,大量繁殖”及“在缺氧、呈酸性的发酵液中,酵母菌能大量生长繁殖”,在教参中提到,酵母菌繁殖需要空气,在完全隔绝空气的情况下,酵母菌繁殖几代就停止了。对这些描述,老师们会有疑问,到底哪一种说法更合理一些呢?

酵母有95个属,将近900个种,每个种的情况都不同,因此笼统的讲就会产生矛盾。有些种的酵母在厌氧条件下完全可以生长繁殖,而且不仅仅是几代的问题;而有些种的酵母在好氧条件下培养,可以大量繁殖,但是转入厌氧条件会很快死亡;有些种的酵母可以继续繁殖,但是当其在好氧条件下积累的能量和物质消耗光后就会死亡。上述情况都存在,只是对不同属、种的酵母情况不同。

对于啤酒酵母来说,在有氧和无氧条件下都可以增殖,只是在无氧条件下增殖要明显少于有氧条件下,因此在生产上常用通气来保证酵母菌的大量增殖。为了不使教师们引起误解,我们会在下一次修订时将这段话再做一些处理。

2.在专题1果酒与果醋的制作中,学生会有这样的疑问:果醋是在果酒产生基础上发酵产生的,在制果酒时需无氧发酵,在无氧条件下,好氧型的醋酸菌不是要大量死亡吗?后期果醋发酵哪来的醋酸菌呢?

在我们的实验中,前期厌氧果酒发酵产生酒精,并不是严格厌氧,因此有少量的醋酸菌存留,当转入好氧发酵时,残存的醋酸菌会大量繁殖,产生醋酸。同时,在我们的实验条件下并不是严格无菌,通入的空气中会有一些醋酸菌,带到发酵液中,大量繁殖,而其他的菌因不适应这种条件而不能繁殖。在工业上,后期醋的发酵是要人工接种醋酸菌的,以保障生产的正常进行,而不是采取我们实验的方法。

另外,在实际操作时,由于菌株的量较少,可能需要很长的时间。为了缩短时间,制作果酒我们可以从市场上买一些菌株;制作果醋我们可以先买一瓶醋,打开盖暴露于空气中,一段时间后在醋的表面有一层薄膜(实际是醋酸菌),可以用这层薄膜进行接种,这样可以明显缩短制作果酒、果醋的时间。

3.在课题“制作泡菜并检测亚硝酸盐含量”中,测定亚硝酸盐含量时,第三步是制备样品处理液,在制作过程中,有三次过滤操作,花费时间较长,每次过滤约需一个小时。有没有比较简单、省事的方法呢?

其实,在实际操作时,教师可以用离心的方法进行过滤。第三次离心后,滤液变得无色透明,可以进行后续实验。离心的目的是缩短过滤时间,通过离心可以使制备样品处理液的过程缩短为一个小时左右。

4.在微生物的培养与应用中,有老师问到,高压灭菌时包裹物品的牛皮纸是否能用塑料膜替代?植物组织培养中用的“硫酸纸”指的是经过如何处理的纸?

高压灭菌时不能用塑料薄膜代替牛皮纸。因为在高温条件下塑料薄膜会熔解破坏,不能达到保护目的,还会黏附在要灭菌的材料上,造成污染。但在实际操作时,老师们可以用旧报纸等质量稍好的纸来进行包裹。硫酸纸是指一种半透明的有相当韧性和强度的薄纸。造纸的纸浆不是普通的纸浆,而经过化学加工的硫酸化纤维素。

5.教材第18页提到平板划线法,那么为什么在接种时接种针不能划破培养基?

不能划破培养基表面是因为,一旦划破,会造成划线不均匀,难以达到分离单菌落的目的;二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落,菌落会沿着划破处生长,会形成一个条状的菌落。

6.平板划线的操作仅是教材中所介绍的一种方法吗?

平板划线法在实际的操作中又分为两种:交叉划线法和连续划线法。教材中介绍的就是交叉划线法。连续划线法是从平板边缘的一点开始,连续作紧密的波浪式划线。教材第14页的右图即可认为是运用的这种方法。

7.教材中提到了巴斯德的鹅颈瓶实验,有老师提到一些学生对此实验──煮沸的肉汤放在鹅颈瓶4年不变质的结论总是充满疑问,为什么能这样呢?

鹅颈瓶是开口瓶,当瓶内外的温度一致时,瓶内和瓶外的压力一样,不存在压力差,此瓶内外没有空气流动,因此微生物就不能够进入瓶内产生污染。而在加热将瓶内的肉汤煮沸时,空气和水蒸气一起通过鹅颈流出瓶外,也将鹅颈部分消毒,并有水蒸气冷凝存留在鹅颈的最低部分,当停止加热,瓶内液体冷却,水蒸气凝结,空气冷却时,瓶内外产生压差,有部分空气会由鹅颈进入,但这些空气须通过鹅颈低处的凝聚的水,这些水会将空气中的微生物吸留,保证了进入瓶内的空气没有微生物,当内外温度平衡后,不会再有空气流动,因此保证了肉汤不腐。

8.在做课题“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”时,最后需要检测脲酶,教材中提到用酚红作为指示剂,有老师问到,能不能用酚酞代替呢?

实验中得到的尿素细菌菌落,它的碱性是非常弱的,做实验时老师们就会发现,大菌落的效果要好于小菌落。酚酞的灵敏度不如酚红,因此建议最好使用酚红,否则效果不明显。

9.测定饮用水中大肠杆菌含量时使用的醋酸纤维素滤膜能不能用显微镜的擦镜纸代替呢?

不能。因为醋酸纤维素滤膜的孔径很小,大肠杆菌不会通过,被截留在膜的表面。而擦镜纸太粗,孔径大,大肠杆菌可以通过,造成测定不准确。同样的道理,在进行细胞培养时,有时需在培养基中添加血清、生长因子、抗生素等,这些物质不能用高压灭菌的方法,因此常常将这些物质配成溶液,用滤膜进行过滤,在使用时加入到已经灭菌的培养基中。直径为0.22 μm的滤膜,可以达到完全除菌的目的。

10.有些老师对教材第62页给出的PCR的循环程序有些疑问,为什么第一次循环和最后一次循环的时间与别的循环不一样呢?

其实这里涉及到几个小问题。

(1)变性时间是如何确定的?在选择的变性温度下,DNA分子越长,两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或时间太短,模板DNA中往往只有富含AT的区域被变性。在应用Taq DNA聚合酶进行PCR时,变性往往在94~95 ℃条件下进行,这也是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最高温度。在PCR的第一个循环中,有时常把变性时间设计为5 min,来增加大分子模板DNA彻底变性的概率,又称此为预变性。当模板DNA的G+C含量超过55%时,需要更高的变性温度,来源于古细菌的DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更能耐受高温,因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。

(2)复性温度的确定有什么考虑?复性过程(即退火)采用的温度至关重要。如果复性温度太高,寡核苷酸引物不能与模板很好地复性,扩增效率将会非常低。如果复性温度太低,引物将产生非特异性复性,从而导致非特异性的DNA片段的扩增。

(3)延伸的时间是如何确定的?Taq DNA聚合酶在最适反应温度(72~78 ℃)下聚合速率约为 2 000 bp/min。根据多数研究者的经验,确定了一个规则,即:靶基因的每1 000 bp的扩增产物的延伸时间被设计为1 min,以此类推。对于PCR的最后一个循环,许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上,以使所有扩增产物完成延伸,这又称为后延伸。

(4)循环数目一般都为30,这个数值是怎么来的?PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率。一旦PCR反应进入几何级数增长期(从教材图中可以看出,是从第三个循环开始;在最初的两个循环中,从一条引物开始的DNA链延伸往往要超越与另一条引物互补的序列,产生第一个与两条引物之间的长度相同的DNA分子),反应会一直持续下去,直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说,扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物,而非特异性的扩增产物应该低到难以检测的程度。用Taq DNA聚合酶(效率约为0.7)在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。

11.教材第63页给出DNA含量的计算公式为:DNA含量(μg/mL)=50×(260 nm的读数)×稀释倍数,其中的50是怎么来的呢?

公式中50的含义:在标准厚度为1 cm的比色杯中,OD260为1相当于50 μg/mL的双链DNA,40 μg/mL的RNA,37 μg/mL的单链DNA以及30 μg/mL的寡核苷酸,因此若是测定RNA的含量,50应该换为40。


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